步驟：
1. 菌株擴增及質粒提取
明舟提供包含質粒的菌株，使用LB進行菌群擴增，每株菌種擴增20ml
pAdTrack-HPV16-L1(virus)-Neo，添加1%的Kan
pLV-EF1a-DsRed-IRES-BSD，添加1%的Amp
psPAX2，添加1%的Amp
pMD2.G，添加1%的Amp
將擴增后的菌種使用質粒小提試劑盒提取5ml質粒，其他菌種保存為甘油菌，置于-80冰箱凍存。
紫外分光光度計測定質粒濃度
2. 片段PCR
PCR體系：pAdTrack-HPV16-L1(virus)-Neo：1μl；
2 × Phanta Max Master Mix (Dye Plus)：25μl；
MluI HPV-L1 F：1.5μl；
NheI rHPV-L1 R：1.5μl；
H2O：補齊至50μl；
共100μl
程序：
預變性：94℃，2min
變性：98℃，10s
退火：56℃，30s
延伸：68℃，20s
終延伸：68℃，5min
共計30個循環。
配置0.8%的瓊脂糖凝膠進行電泳，使用FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit回收PCR產物，使用紫外分光光度計計算產物濃度
3. 酶切
由于Miu I及Nhe I Buffer不通用，因此分段進行酶切
片段體系1：
Nhe I ：1μl；
Nhe I Buffer：2μl
PCR產物：1μg；
H2O：補齊至20μl。
共20μl，37℃酶切1h
片段體系2：
Miu I ：1μl；
Miu I Buffer：5μl
片段體系1：20μl；
H2O：補齊至50μl。
共50μl，37℃酶切1h
載體體系1：
Nhe I：1μl
Nhe I Buffer：2μl
pLV-EF1a-DsRed-IRES-BSD：1μg
H2O：補齊至20μl。
共20μl，37℃酶切1h
載體體系2：
Miu I ：1μl；
Miu I Buffer：5μl
載體體系1：20μl；
H2O：補齊至50μl。
共50μl，37℃酶切1h
配置0.8%的瓊脂糖凝膠進行電泳，使用FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit回收酶切產物，使用紫外分光光度計計算產物濃度
4. 連接
連接體系：
T4 DNA Ligase：1μl
T4 Buffer：1μl
酶切片段體系2產物：5μl
酶切載體體系2產物：3μl
共10μl，配置20μl
置于金屬浴16℃連接過夜
5. 轉化
將兩支Stbl3大腸化轉感受態從-80冰箱取出，置于冰上融化。向Stbl3大腸化轉感受態，加入連接產物，每支10μl，置于冰上30min。42℃熱激活30s。置于冰上5min。向Stbl3大腸化轉感受態加入1ml無抗LB，37℃，250rpm，激活1h。離心菌株，取含1%AMP的LB瓊脂平板，向平板滴加菌液并涂布均勻。置于37℃培養過夜。
6. 菌株篩選
菌板挑取9個菌落，分別置于1ml AMP LB中擴增，同時進行菌落PCR
菌落PCR體系：
2 × Taq Master Mix (Dye Plus)：10μl
MluI HPV-L1 F：1μl
NheI rHPV-L1 R：1μl
H2O：補齊至20μl
共20μl，配置200μl（10支）
配置0.8%的瓊脂糖凝膠進行電泳，挑選陽性菌株。
7. 測序鑒定
將篩選為陽性的菌液進行送測鑒定
8. 菌株擴增
將測序結果正確的菌株使用20mlLB進行擴增，取15ml菌液提取質粒，剩余菌液凍存至-80
9. 細胞準備
提前準備培養HEK 293T細胞，在轉染前一天將細胞傳代至6CM平板，數量約為150萬/板，細胞生長正常即可使用。
10. PEI轉染
(1) DNA稀釋液的準備
對一個6cm平板，取試管加入100μl細胞培養液（無血清、雙抗）及4μg質粒，按照質量比
pLV-HPV-L1-EF1a-DsRed-IRES-BSD：psPAX2：pMD2.G=4:3:1，
即pLV-HPV-L1-EF1a-DsRed-IRES-BSD：2μg，psPAX2：1.5μg，pMD2.G：0.5μg。
根據測定的質粒濃度
即pLV-HPV-L1-EF1a-DsRed-IRES-BSD：6.8μl，psPAX2：5.3μl，pMD2.G：2.5μl
使用移液器輕輕吹打混勻。
（2）轉染試劑的準備
對一個6cm平板，取試管加入84μl細胞培養液（無血清、雙抗）及16μl PEI，使用移液器輕輕吹打混勻。
（3）轉染復合物的準備
將配置好的轉染試劑加入配置好的DNA稀釋液中，使用移液器輕輕吹打混勻，室溫孵育20min。
（4）細胞轉染
將6cm平板培養上清棄去，加入5ml新鮮的培養液（無血清、雙抗）。將轉染復合物均勻滴加到平皿中，培養6h。
培養6h后，每個平皿補加5%的血清，繼續培養48h。
共轉染6cm平板4個，共需要LV-HPV-L1-EF1a-DsRed-IRES-BSD：27.2μl，psPAX2：21.2μl，pMD2.G：10μl，DMEM：341.6μl
PEI：64μl，DMEM：336μl
11. 病毒收集
將轉染后的細胞繼續培養48-72h。收集細胞上清，500g離心10min，收集上清。使用除菌濾器過濾收集上清。
12. 病毒滴度檢測
使用慢病毒滴度檢測試劑盒，檢測慢病毒滴度。
13. 病毒感染
培養HEK 293細胞，6孔板，鋪HET293細胞1板，每孔細胞約為5x105；鋪293T細胞1板，每孔細胞約為3x105。
培養過夜，細胞匯合度約50%。感染時，棄去原本培養基，向每孔加入培養基1ml，隨后分別向孔內滴加0、50、100、200、400μl病毒上清。感染后4h，更換新鮮培養基至2ml。
48h后，除陰性孔外，每孔更換含10%病毒上清的新鮮完全培養基，繼續在溫箱中進行培養。
14. 穩轉細胞篩選
病毒感染后48h，可使用熒光顯微鏡紅光模式觀察細胞感染情況。
將感染較多的孔，擴增至48孔板，在縱列建立滅瘟素S殺傷梯度曲線，其濃度從上至下分別為：0μg/ml，2.5μg/ml，5μg/ml，10μg/ml，20μg/ml，40μg/ml，共計6個梯度。同時建立陰性細胞殺傷曲線。
每3日更換一次培養基，直至10d左右，觀察陰性曲線及實驗組殺傷情況，若陰性曲線細胞死亡不足，則適當延長培養時間。
15. 單克隆細胞株的篩選
收集在高濃度BSD中生長的細胞，并擴增3代，凍存細胞后將細胞進行有限稀釋度法篩選單克隆細胞。
結果：
1. 質粒提取
pAdTrack-HPV16-L1(virus)-Neo及pLV-EF1a-DsRed-IRES-BSD擴增，共擴增20ml。
收獲質粒：
pAdTrack-HPV16-L1(virus)-Neo 60μl，濃度93.4ng/μl。
pLV-EF1a-DsRed-IRES-BSD 60μl，濃度277.7ng/μl
2. 片段擴增
F1. HPV16-L1片段PCR電泳
片段PCR產物電泳可見，產物大小約為1500bp，與預期結果1518bp接近，確認片段擴增成功。回收后片段濃度為455ng/μl
3. 酶切回收
F2. HPV16-L1片段及pLV-EF1a-BSD，Miu I、Nhe I雙酶切后電泳
酶切后可見片段及載體已經酶切完全，片段位置與預期大小相符，回收后載體濃度為11.3ng/μl，片段濃度為13.3ng/μl。
4. 轉化與陽性菌落篩選
F3. 酶切片段連接后轉化的菌板
轉化感受態并涂板，過夜培養后可見細菌生長良好。挑取9株菌株進行1ml擴增，并同時進行菌落PCR。
F4. 菌落PCR檢測電泳圖
菌落PCR檢測可見，所有菌株均有條帶，但條帶大小不一致。懷疑可能為PCR產物過多，且電泳電壓太大導致。將2/4/5/8/9號菌株送測，同時將L1 PCR擴增回收產物送測
經測序檢測，9號菌株測序結果正常無突變。
5. 三質粒系統提取
擴增9號及兩個包裝質粒，檢測顯示，三質粒濃度分別為9#：292ng/μl，pMD 2.G：204ng/μl，psPAX2：283ng/μl
6. 收毒
收取轉染后病毒上清，使用慢病毒檢測卡檢測慢病毒滴度
F5. 慢病毒滴度檢測試劑卡檢測轉染細胞上清
F6. 慢病毒滴度檢測試劑卡檢測空白上清
F7. 慢病毒滴度比色卡
經比對，確認慢病毒顆粒數約為3x109/ml，感染粒子濃度約為3x106/ml
