為了構(gòu)建用于過表達靶基因的質(zhì)粒，將PtrpC-hph、 PtrpC-bar和PtrpC-neo分別克隆到pNA52-1N中形成pNA52-hph、pNA52-bar和pNA52-neo。將組成型tef1啟動子和密碼子優(yōu)化的NP_594777融合并組裝到pNA52-hph中形成過表達Spmae的質(zhì)粒pPtrpC-Spmae-hph。將Te強組成型gpdA啟動子插入pNA52-bar中生成質(zhì)粒pAN52-PgpdA-bar。用引物從大腸桿菌基因組中擴增出Ecfum的開放閱讀框。對Ckfum，Msfum和Rofum進行了密碼子優(yōu)化和人工合成，并克隆到pAN52-PgpdA-bar中，得到pAN52-pgpdA-A-pgpdA-Msfum-bar、pAN52-pgpdA-Ckpfum-bar和pAN52-PgpdA-Rofumbar。將擴增后的Peif和Mtsfc片段組裝進pAN52-neo，獲得質(zhì)粒pPeif-Mtsfc-neo。使用sgRNACas9工具，以嗜熱分枝桿菌基因組序列和靶基因為輸入，鑒定了fr1、fr2、Mtfum、moc和Mtmae中的特異性sgRNA靶位點。選擇脫靶概率低的寡核苷酸。用引物從U6p sgRNA質(zhì)粒中擴增U6啟動子和靶向sgRNA片段，通過重疊PCR組裝，并克隆到pJET1.2/鈍性克隆載體中，形成質(zhì)粒U6-fr1-sgRNA、U6-fr2-sgRNA、U-6Mtfum-sgRNA、U6-moc-sgRNA和U6-Mtmae-sgRNA。用引物從嗜熱分枝桿菌基因組中擴增出fr1、fr2和Mtfum的5′和3′側(cè)翼片段并和選擇性標記盒PtrpC-neo進行組裝，克隆到用SpeI/EcoRV消化的pPK2BarGFPD中，產(chǎn)生供體DNA序列donor-fr1-neo、donor-fr2-neo和donor-Mtfum-neo。通過將TrpC的組成型啟動子和選擇性標記基因nat融合，得到PtrpC-nat。PtrpC-nat用引物擴增，與moc側(cè)翼片段融合，并從嗜熱分枝桿菌基因組中擴增Mtmae，插入pPK2BarGFPD中的SpeI/EcoRV之間，以產(chǎn)生供體DNA序列donor-moc-neo和donor-Mtmae-neo。

參考文獻：Gu S, Li J, Chen B, Sun T, Liu Q, Xiao D, Tian C. Metabolic engineering of the thermophilic filamentous fungus Myceliophthora thermophila to produce fumaric acid. Biotechnol Biofuels. 2018 Dec 3;11:323.