首先從細胞培養(yǎng)開始吧。我用的是A549，A549總體感覺還是好養(yǎng)的，也不嬌氣。A549的培養(yǎng)絕大多數(shù)的文獻都說用1640，但是我的體會是用DMEM更好，因為經(jīng)高人指點，發(fā)現(xiàn)A549在偏減性環(huán)境長得更好。一開始也是用1640，細胞總是有部分漂起來，即便是用PBS洗后仍然會有部分漂浮。后來換成DMEM,且血清最好用GIBCO的。以后細胞就開始長好了。這種細胞對濃度依賴更強，所以在傳得時候濃度要高一點，最好一傳二。最好是細胞鋪滿瓶底80-90%時，就傳。傳晚了細胞就疊層。有幾次傳稀了，細胞就集中在一些地方長，沒有均勻的鋪展開來。甚至細胞就在扎堆的地方疊層生長，也不連接成片，這樣的細胞自然不能拿去接種。這樣就只能消化下來原瓶傳，以后細胞漸入佳境。
到快要接種前兩周，我基本上是一天傳一次。用于接種的細胞最好傳15代后再用，因為代數(shù)越高，活力越強，細胞生長非常好。由于我的實驗接種的濃度較高，所以我用75cm2的瓶，整整養(yǎng)了99瓶。現(xiàn)在回想起來，真不知當時是怎么熬過來的。主要是A549個頭較大，所以75cm2的瓶長的滿滿的也就在106，如果按文獻5×107（大多數(shù)文獻），我接種60只，還得繼續(xù)擴大瓶數(shù)，不過我發(fā)現(xiàn)106數(shù)量級就非常好了，不一定必須是5×107。這或許跟我最后細胞的狀態(tài)有關。另外我發(fā)現(xiàn)A549更喜歡玻璃瓶，而且是玻璃瓶越小越好，不知是我的主觀感覺還是事實就是這樣。因為一開始我是用玻璃瓶養(yǎng)，后來計算，發(fā)現(xiàn)用量需很大的量時，才改用75cm2的塑料瓶。
關于細胞養(yǎng)的過程中的一些細節(jié)：1）雙抗的配制：去一支80萬單位的青霉素溶于4ml的NS，再取一支100萬單位的鏈霉素溶于5ml的NS，取4ml與前者混合節(jié)。1ml分裝與1.5美麗的EP管，-20℃保存，臨用前再解凍。2）消化細胞胰酶最好用GIBCO的。可以將胰酶分裝在1.5ml的EP管里，每管1ml，-20℃保存，臨用前再解凍。3）完培、PBS、胰酶均沒必要提前溫浴，4℃拿出即可用。4）消化細胞時由于選用GIBCO的，所以沒必要在培養(yǎng)箱里消化，室溫即可。時間1分鐘左右。1ml的胰酶可以重復利用，可消化4瓶細胞，甚至可以消化6瓶，不過越到后面消化所需的時間就越長。這樣對細胞不利，因為瓶里沒有完培了。當然消化之前必須用PBS洗。如果不洗的話，在吹打時就比較費時費力了。所以洗很關鍵，因為PBS液可帶走殘留的血清，以提高酶的活性。5）消化細胞時一定要掌握好火候，鏡下觀察到細胞連接松散了，即立即停止消化。吸走胰酶用于下一瓶的消化。6）加入完培吹打，此時可沿瓶底快速擠入完培，如果手勁夠大的話幾乎不用吹細胞都已經(jīng)掉下來了。吹打時間竟可能短一些，氣泡少一些。對于A549來說，可以快速地吹一二十次即可，因為GIBCO的胰酶消化效果非常好。不過反復使用后，應該適當延長消化時間，且盡可能的把PBS吸干凈。7）加好完培后輕輕晃一下培養(yǎng)瓶，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。特別提醒，首次復蘇的細胞，不要總去動它，可以第5天再去換液。因為剛復蘇的細胞較嬌嫩，不易頻繁去動它（新手容易犯這樣的錯誤）。
和多數(shù)文獻一樣接種后A549是有些長的慢，我的實驗在第18天時，60只里有48只到達遴選標準（100-300mm3），剩下20只，有2/3較小、1/3超過均不能用。我自認為接種成功率比較高了，當然這得益于我身邊有一位近40年經(jīng)驗的高人。許多人接種率不高的原因，我個人體會是，除了與你的瘤株的活性（無論你是體外培養(yǎng)，還是體內培養(yǎng)）有密切關系外，還有就是動物的周齡，我個人體會最好4周，動物買來后適應1天就接種。還有后期管理也很重要，特別是NS組，有些人就不給NS，認為沒必要，其實很重要，NS組瘤重平均值應該在2g-3g，標準差應在平均值的1/3-1/4，否則數(shù)據(jù)根本就不可信，實驗就是白做。決定成功率的還有一個關緊因素是，接種部位，這個非一日之功。我的成功率較高（姑且自詡一下），正如我前面所說，身邊有高人太重要了。所以在這里斗膽建議大家在做類似實驗時，身邊一定要有高人指點，否則你可能會走很多彎路，這樣寧可不做。無論你是用什么鼠，在接種時，首先就是如何抓動物。在抓動物時每一只的手法和力量要盡量一致，抓好后把動物側面面向自己，此時小鼠的身體呈一弧形，整個側面的皮膚繃緊。用小手指先壓住尾巴，再把右后肢向尾部反向拉一下（注：左手抓動物），再用無名指壓住右后肢。此時整個小鼠的、用來注射的側面的皮膚已經(jīng)繃得較緊了。這樣做的目的是保證細胞懸液在注射后都集中在比較小的區(qū)域，不至于四處擴散，反而使局部的濃度減少，影響到成瘤和瘤塊的均一性（不過均一的瘤塊是可遇不可求的一件事！）。大家可能覺得裸鼠掌握不好注射部位，因為裸鼠的皮膚彈性差。其實裸鼠更好注射，因為裸鼠體表無毛，皮膚是看的見的，有沒有在皮下很容易感覺得到。反而是其他有毛的小鼠看不見皮膚，需要小心一點。
進針點的選擇你可以選離腋窩大概1.5cm的地方。如果我們從腋窩沿身體的側面（正俯位的右側）貼著軀體表面與軀體平行劃一根線的話。那么進針點就應該選在離腋窩1.5cm、“線”的左側。針頭進去后應該斜向下（偏右方向）到達腋窩空曠的地方，剛好是6號針頭的2/3(注意：針頭不能太小，否則易堵。有一次我用4號就有點堵，當時是瘤塊的勻漿。)。之前肯定要消毒干凈，而且面積大一些好點。因為畢竟裸鼠免疫力低。細胞懸液最好注射在腋窩離得腋下靜脈叢周圍，且不要傷及靜脈。聽起來好像很懸吧，其實做多了，感覺就來了。這樣就會保證你每只都接種成功。皮下接種最好選擇腋下，因為這里血流豐富，可保證瘤塊很好的生長。
在無菌室制備好的細胞懸液，最好用一無菌的玻璃瓶（一定要帶膠塞）裝好，再置于冰面上，再帶到動物房注射。許多教科書多說，從消化細胞開始到制備成懸液，再到接種最好在30min內結束，我覺得這有點不切實際。如果是接種一兩動物是可以做到的，但幾十只時，無論是什么樣的高手也做不到。以我為例，我接種60只，我養(yǎng)了99瓶細胞，我從上午8點開始處理細胞，一直到下午3點才把細胞懸液制備好（3個人分工協(xié)作），反而是接種只花了30min。
在接種細胞時，每一只動物的用量一定要統(tǒng)一，且注射器在吸得時候也一定要非常準確，這對于將來的成瘤影響很大。每次吸時一定要充分混勻，且搖的次數(shù)都要一樣，千萬不要小看這些細節(jié)。由于裸鼠的皮膚彈性有些差，所以當完成注射，將針頭拔出時會有明顯的針眼，因此在注射完懸液和拔針之前最好下壓針頭，以免液體從針眼處流出，導致注射的量減少，使瘤塊不均一。當然注射前的消毒工作一定要做好，這毋庸置疑。特別是脫碘時一定要干凈，否則會將碘帶入裸鼠體內，那你就只有哭了。裸鼠太嬌貴了。
接種使用組織瘤塊好，還是細胞好。要根據(jù)你的模型需要決定。我用的A549移植瘤模型就應該選“細胞”，因為A549成瘤慢。如果用“組織瘤塊”的話，可能要花3個周期（每個周期20天左右，體內必須傳3代后才能用。如果有現(xiàn)成的成瘤裸鼠賣的話就另當別論了，買來就可以用。）
