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神經細胞培養

 

神經細胞(神經元)不易培養,只有在適宜情況下,如接種在膠原底層上,或加入神經生長因子和膠質細胞因子時,可出現一定程度的分化,長出突起等現象,但很難使之增值。而神經膠質細胞是神經組織中比較容易培養的成分。

人、鼠等腦組織即可用于神經膠質細胞培養,不僅能獲得生長的膠質細胞,也可形成能傳代的二倍體細胞系。一般說來,膠質細胞在培養中生長不穩定,不易自發轉化,但對外界因素仍保持很好的敏感性,可用ROUS病毒和SV4等誘發轉化。

一. 設備:

無菌操作設備。

二. 大型設備

CO2培養箱:恒溫5%、10%CO2維持培養液中pH值。
倒置顯微鏡:用于每天觀察貼壁細胞生長情況。
解剖顯微鏡,用于準確地取材。
常溫冰箱:-4,用于保存各種培養液,解剖液和鼠尾膠。
低溫冰箱:-20--80,用于儲存血清酶,貴重物品和試劑。
電熱干烤箱:用于消毒玻璃器皿。
高壓消毒鍋:用于消毒培養皿,手術器械。
過濾器:配制解剖液、培養液,必須過濾后才可使用,以去除細菌。
滲透壓儀,pH劑,天平等。

三. 培養器皿及手術器械

1 培養皿:常用35mm塑料及玻璃皿,解剖取材用15mm-90mm直徑。
2
培養板,24-40孔,可用于開放培養。
3
培養瓶:
4
吸管,常用15,10ml,均需泡酸、洗滌、滅菌后方可使用。
5
各類培養液貯存器。
6
小型手術器械。

準備:

配制培養液

1 解剖液:以無機鹽(去除Ca2+, Mg2+)加葡萄糖配制成PBS緩沖液,保持一定的滲透壓和pH值。
2 基礎培養基(MEM):主要為多種氨基酸,加入葡萄糖,雙蒸餾水溶解。
3 接種培養液:用于胰酶消化后的細胞分散,做成細胞懸液,其成分為MEM1%谷氨酰胺,另加入10%馬血清,當天配制。
4 維持培養液:接種后24h,全部換成此液,后每2周換一次,每次換1/2。其成分為MEM中含5%馬血清,1%谷氨酰胺,及適量的支持性營養物質。

培養基質

常用鼠尾膠、小牛皮膠,多聚賴氨酸,再涂膠

消毒培養皿的備用。

所有培養器皿均需清水沖洗2-3d,達兩次ddH2O,每遍洗刷3-4次,加塞包裝,置于烤箱中干燥消毒,于培養前1天進行。

神經細胞分散培養

(一) 選材 常用胚胎動物或新生鼠神經組織。雞胚常用胚齡6-8d,新生鼠或胎鼠(12-14d)或人胚胎。不過也有認為與組織相關。如大白鼠胚胎以19d為宜,小鼠以18d為宜,大鼠紋狀體以10d為宜;若紋狀體與黑質聯合培養的大鼠胚,則黑質以13d,紋狀體18-21d為宜;小腦以20-21d小鼠胚胎,所獲蒲氏細胞成活率高,顆粒細胞正在分化;脊髓與DRG聯合培養,常用4-7d雞胚或12-14d小鼠胚胎,取材易,神經成活率高。

(二) 取材。腦則取出相應組織,在解剖液中先剪碎,以使胰酶消化。脊髓則固定于瓊脂板上,用小刀將其要成背腹兩側,分別培養。

(三) 細胞分離與接種。神經組織用0.125-0.25%胰蛋白酶在37孵育30min,移入接種液,停止消化,并洗去胰蛋白酶液,用細口吸管吹打細胞懸液,使其充分分散,如此多次,待沉淀后吸出上層細胞懸液,計數,預置細胞密度,接種于培養皿(1×106),做電生理應為5×105或更低。

(四) 抑制膠質細胞生長。培養3-5d后,也有人認為培養7d后,用阿糖胞苷,或5-FU抑制神經膠質細胞的生長。

(五) 觀察。接種6-12h,開始貼壁,并有集合現象,細胞生長突起明顯,5-7d膠質細胞增生明顯,7-10d膠質細胞成片于神經細胞下面,形成地毯,2周時神經細胞生長最豐滿,四周暈光明顯,一個月后,有些神經細胞開始退化,變形,甚至出現空泡,一般培養2-4周最宜。

但神經細胞只能增大,而不能增殖,只能原代,不能傳代,不會有細胞周期,而且隨培養時間的延長,細胞數量在下降,但膠質細胞可以,神經膠質細胞也可以。在培養過程中,早期9-12d時,有較多的神經細胞死亡,這是第一次死亡階段,應注意保持條件的恒定。在此之后存活下去的細胞一般突起長而多,且相互形成突觸。

(六) 常用培養細胞實驗有:

FCM的蛋白總量分析;膜片鉗與離子通道的分析;免疫組化分析;

但免疫組化分析應注意,由于抗體直接作用于活細胞,不易穿透活細胞,故對核內抗原定位時,首先考慮膜對抗體的通透性問題。常用化學試劑以增加其通透性或采用冰凍方法解決。

在免疫組化中,或其它組織學染色中,常用不同的染色方法以區分不同細胞,如半乳糖腦苷脂對小樹突膠質細胞標記明顯;GFAP對星形膠質細胞具有特異性染色等。這對研究神經系統中膠質細胞功能具有極大的應用價值。神經膠質細胞以往多被忽視,其在腦血管疾?。ㄈ缛毖該p傷)、退行性疾?。ㄈ?/span>ADPD)、損傷后膠質細胞的填充等具有不可忽視的作用。它也是神經細胞功能和營養支持的物質基礎。

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