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菌株的傳代-保藏-復(fù)壯

標(biāo)準(zhǔn)菌驗(yàn)收、制備、保藏、 傳代、使用、銷(xiāo)毀的管理

介紹了微生物實(shí)驗(yàn)中使用的標(biāo)準(zhǔn)菌的驗(yàn)收、制備、保藏、 傳代、使用、銷(xiāo)毀的管理規(guī)程 規(guī)定了質(zhì)量管理部門(mén)實(shí)驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)菌種的驗(yàn)收、制備、儲(chǔ)管、使用、以及銷(xiāo)毀等的相關(guān)規(guī)定。適用于微生物限度檢查、無(wú)菌檢查、抗生素微生物(效價(jià))測(cè)定、評(píng)價(jià)防腐劑和抗菌劑的抑菌效果和確認(rèn)滅菌效果、檢驗(yàn)方法的驗(yàn)證、培養(yǎng)基的適用性檢查,樣品檢驗(yàn)時(shí)的陽(yáng)性對(duì)照等。
依據(jù): 中國(guó)藥典2010年版二部及菌種使用說(shuō)明書(shū)
1.
標(biāo)準(zhǔn)菌的來(lái)源
標(biāo)準(zhǔn)菌株由中國(guó)藥品生物制品檢定所醫(yī)學(xué)菌種保藏中心(China Medical culture collection ,CMCC)提供的冷凍干燥菌種(0代)或由上級(jí)藥檢部門(mén)已接種好的菌種斜面(3代)。黑曲霉的0代菌種為保存于含15%甘油的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液中的孢子懸液冷存管。中國(guó)藥品生物制品檢定所醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心提供的冷凍干燥菌種的標(biāo)簽CMCCB)代表細(xì)菌(bacteria,CMCC(F)代表真菌(fungi)每種菌具有固定的代號(hào)。

2.
標(biāo)準(zhǔn)菌的驗(yàn)收
從菌種保藏中心購(gòu)買(mǎi)的原始菌種管是玻璃安瓿裝的凍干菌,接收同時(shí)應(yīng)檢查是否有隨菌種附有的相關(guān)資料。接收菌種時(shí)應(yīng)檢查安瓿的數(shù)量和名稱(chēng),和每一支安瓿的完整性。在相應(yīng)的菌種接收記錄上記上所有的關(guān)于菌種的信息,如名稱(chēng)、數(shù)量和接收日期等。在菌種安瓿及菌種管上粘貼標(biāo)簽,內(nèi)容包括:菌種名稱(chēng)、菌種代號(hào)、代次、接收日期、接收人、貯存條件、有效期至。新購(gòu)入的0代原始菌種儲(chǔ)存于-20,有效期為三年。從上級(jí)藥檢部門(mén)購(gòu)買(mǎi)的已接種好的菌種斜面(3代)應(yīng)檢查菌種管是否完好。儲(chǔ)存于2 8 ,有效期為3個(gè)月。

3.
標(biāo)準(zhǔn)菌的復(fù)蘇、復(fù)壯及標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株的制備

3.1
物品及試劑:接種針、酒精燈、移液管、75%酒精及75%酒精棉球

3.2
培養(yǎng)基
改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基:用于黑曲霉復(fù)蘇、復(fù)壯.
液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基:用于生孢梭菌復(fù)蘇、復(fù)壯.
營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基:用于金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門(mén)菌、短小芽孢桿菌、銅綠假單胞菌復(fù)蘇、復(fù)壯。
改良馬丁培養(yǎng)基:用于白色念珠菌復(fù)蘇、復(fù)壯.

3.3
操作步驟:
a.
打開(kāi)潔凈工作臺(tái)。
b.
在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并讓其自然風(fēng)干。
c.
用一小砂輪在安瓿的上部劃一條線,用手輕輕將安瓿掰開(kāi)(開(kāi)啟安瓿時(shí)必須小心,因?yàn)榘碴秤鰺釙r(shí)可能會(huì)破裂)。
d.
以無(wú)菌方法用一無(wú)菌吸管從已準(zhǔn)備好的上述液體培養(yǎng)基中移取0.50.8 ml到安瓿中。
e.
輕輕地旋轉(zhuǎn)安瓿以使凍干菌種和液體培養(yǎng)基充分混合并完全溶解。
f.
用無(wú)菌吸管將安瓿內(nèi)菌液全部轉(zhuǎn)接到相應(yīng)的液體培養(yǎng)基。
g.
根據(jù)安瓿上所標(biāo)明的不同菌種類(lèi)型而將其培養(yǎng)于相應(yīng)的溫度(細(xì)菌培養(yǎng)溫度3035,培養(yǎng)1824小時(shí);真菌培養(yǎng)溫度2328,培養(yǎng)35天。觀察是否渾濁,渾濁說(shuō)明菌種復(fù)蘇生長(zhǎng);若不渾濁,細(xì)菌應(yīng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至7天,真菌應(yīng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至14天,若仍未渾濁,滅菌處理。
h.
黑曲霉的菌懸液先室溫待菌懸液融化后用無(wú)菌吸管吸取管內(nèi)液體12滴滴在改良馬丁瓊脂斜面上,用吸管涂布均勻,置2328培養(yǎng)57天,斜面正面為黑褐色厚絨狀,色澤均一,不應(yīng)有雜色,斜面?zhèn)让鏌o(wú)色,接近菌層培養(yǎng)基略帶黃色。確認(rèn)后用含有0.05%ml/ml)的吐溫-800.9%無(wú)菌氯化鈉溶液洗脫到無(wú)菌試管中。
i.
取經(jīng)復(fù)蘇后的上述細(xì)菌菌液8-10ml至液體培養(yǎng)基中按g項(xiàng)操作對(duì)菌種進(jìn)行復(fù)壯。以無(wú)菌技術(shù)向復(fù)壯后的菌種中加入100ml20%的無(wú)菌甘油混勻,1-2ml/管分裝于凍存管。每個(gè)菌種制備10支,按順序進(jìn)行編號(hào),最后一支做為質(zhì)控管進(jìn)行質(zhì)量控制,即進(jìn)行相應(yīng)的確認(rèn)。其余作為儲(chǔ)備管。黑曲霉的h項(xiàng)下洗脫液按h項(xiàng)下方法進(jìn)行復(fù)壯,制成復(fù)壯后的孢子懸液20ml。以無(wú)菌技術(shù)向復(fù)壯后的菌種中加入20ml 、30%的無(wú)菌甘油混勻,1-2ml/管封存于凍存管。制備10支,按順序進(jìn)行編號(hào),最后一支做為質(zhì)控管進(jìn)行質(zhì)量控制,即進(jìn)行相應(yīng)的確認(rèn)。其余作為儲(chǔ)備管。將上述制備好的凍存管逐支粘貼標(biāo)簽。內(nèi)容包括:菌種名稱(chēng)、菌種代號(hào)、編號(hào)、代次、制備日期、制備人、貯存條件、有效期至等。
j
.儲(chǔ)備菌種管制備成功,儲(chǔ)存于-20,有效期為三年。

3.4
菌種確認(rèn)
用無(wú)菌接種環(huán)從質(zhì)控管中取細(xì)菌培養(yǎng)物接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上,或相應(yīng)的宜于該細(xì)菌生長(zhǎng)的鑒別平板上,劃線分離出單個(gè)菌落。然后在3035下培養(yǎng)23天;同樣的方法取真菌到玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平板,并在2328下培養(yǎng)7天;培養(yǎng)后,觀察其菌落形態(tài),應(yīng)符合該菌種形態(tài)特征。

3.5
污染處理
假如在該平板上發(fā)現(xiàn)有其他菌落生長(zhǎng),則說(shuō)明或操作有污染或菌種不純。將此被污染了的培養(yǎng)物滅菌處理。可尋找原因重新分離挑選純菌落轉(zhuǎn)接斜面菌種作為第四代。并重新制備儲(chǔ)備菌種管

3.6
菌種的傳代與保藏
將菌種接種至一新鮮培養(yǎng)基上,每萌發(fā)一次即稱(chēng)為一代,因此,當(dāng)原始菌種復(fù)溶并轉(zhuǎn)至新培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng),即認(rèn)為已傳代一次,從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥的菌種為第0代,冷凍干燥的原始菌種開(kāi)啟后轉(zhuǎn)種后為第1代,直到第3代為工作菌種。菌種的傳代次數(shù)(自原始菌種凍干粉起)不得超過(guò)5代。

菌種的傳代保藏過(guò)程
3.3
項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)菌的復(fù)蘇為傳第一代,復(fù)壯為第二代。 傳第三代時(shí)取1支凍存管自然解凍,將其轉(zhuǎn)接斜面菌種作為工作用菌種。此時(shí),工作用菌種為第3代。工作用菌種,分為兩類(lèi):一類(lèi)用于定期傳代(W3),一類(lèi)用于實(shí)驗(yàn)用(S3)。
定期傳代用菌的傳代其操作步驟如下(斜面接種法):
1)從冰箱冷藏室中取出菌種斜面后,應(yīng)在室溫放置約30分鐘。
2)將裝有新鮮配制的培養(yǎng)基菌種保藏管管壁上注明菌名及接種日期,和傳代菌種一并移入潔凈工作臺(tái),打開(kāi)紫外燈照射一小時(shí)。
3)關(guān)閉紫外燈。點(diǎn)燃酒精燈,左手握住菌種斜面,將管口靠近火焰上方,右手拿接種棒后端,將接種環(huán)燒紅約30秒,隨后將接種棒金屬部分在火焰上燒灼,往返通過(guò)三次。
4)右手用無(wú)名指、小指及掌部夾住管塞,左手將管口在火焰上旋轉(zhuǎn)燒灼,右手再輕輕拔開(kāi)管塞,將接種環(huán)伸入管內(nèi)先在近壁的瓊脂斜面上靠一下,稍冷后再至菌苔上,刮取少量菌苔,隨即取出接種棒并將菌種管口移至火焰上方?!?/span>
5)塞上管塞,左手將菌種管放下,取營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面(或改良馬丁瓊脂斜面)一支,照上述操作打開(kāi)管塞,將接種環(huán)伸入管內(nèi)至瓊脂斜面的底部向上劃一條直線,然后從底部向上作連續(xù)曲線劃線,一直劃到斜面頂端,使細(xì)菌接種在斜面的表面上。
6)取出接種環(huán),在火焰上方將培養(yǎng)基管蓋上塞子,然后將接種過(guò)細(xì)菌的接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌。
7)將已接種好的細(xì)菌管置3035細(xì)菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)22 24h,真菌管置2328真菌培養(yǎng)箱最多培養(yǎng)7天。

當(dāng)工作用菌種傳代代數(shù)小于5時(shí),可直接用上一代工作用菌種轉(zhuǎn)接下一代工作用菌種,如:(W3)可直接轉(zhuǎn)接為(W4)。按上述程序操作,直至(W4)轉(zhuǎn)為(W5)為止,需重新接種,舊的工作菌種進(jìn)行銷(xiāo)毀。

菌種斜面的培養(yǎng)、保藏條件及時(shí)間
菌種 培養(yǎng)條件及時(shí)間 培養(yǎng)基 保存條件及時(shí)間
大腸埃希菌(CMCC(B)44102) 303522 24h 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 2 8 保存3個(gè)月
金黃色葡萄球菌(CMCC(B)26003) 303522 24h 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 2 8 保存3個(gè)月
枯草芽孢桿菌(CMCC(B)63501) 303522 24h 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 2 8 保存3個(gè)月
銅綠假單胞菌(CMCC(B)10104) 303522 24h 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 2 8 保存3個(gè)月
乙型副傷寒沙門(mén)菌(CMCC(B)50094) 303522 24h 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 2 8 保存3個(gè)月
生孢梭菌(CMCC(B)64941) 303522 24h 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 2 8 保存3個(gè)月
白色念珠菌(CMCC(F)98001) 2328 最多7 改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基 2 8 保存3個(gè)月
黑曲霉(CMCC(F)98003) 2328 最多7 改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基 2 8 保存3個(gè)月
短小芽孢桿菌(CMCC(B)63602) 303522 24h 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 2 8 保存3個(gè)月
注:菌種斜面1/周觀察狀態(tài)是否正常。

3.7
菌種的使用及銷(xiāo)毀
每次進(jìn)行菌種復(fù)活時(shí),只能復(fù)活一個(gè)菌種。如果要復(fù)活其他菌時(shí),應(yīng)對(duì)所用物品重新消毒滅菌。
每次操作,都應(yīng)進(jìn)行記錄。菌種管上應(yīng)貼有牢固的標(biāo)簽。標(biāo)明菌種名稱(chēng)、菌種代號(hào)、代次、傳代人、編號(hào)和傳代日期、貯存條件、有效期至等。
廢棄菌種及實(shí)驗(yàn)用品廢棄物的處理:121 高壓蒸汽滅菌20分鐘。并對(duì)操作過(guò)程進(jìn)行記錄。

 

藥典菌懸液制備是要菌種的新鮮培養(yǎng)物接種至培養(yǎng)基中,培養(yǎng)18-24h再進(jìn)行稀釋?zhuān)苽渚鷳乙海?/span>

 

哥倫比亞血瓊脂平皿生長(zhǎng)的菌落,對(duì)氧化酶試驗(yàn)是否有影響?菌懸液的制備過(guò)程中,接種菌種新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中,這個(gè)新鮮培養(yǎng)物怎么理解,冰箱保存斜面菌種是新鮮培養(yǎng)物嗎?答:沒(méi)使用過(guò)哥倫比亞血瓊脂及相關(guān)實(shí)驗(yàn)。新鮮培養(yǎng)物指剛培養(yǎng)好的菌株,冰箱保存斜面菌種不算新鮮培養(yǎng)物。

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