CRISPR/Cas 基因編輯技術(shù)極大提升了對(duì)多物種基因組的編輯效率，這為乳酸菌功能基因的快速鑒定及遺傳改良提供了可能。

目前多利用外源 II 類 CRISPR/Cas 系統(tǒng)對(duì)細(xì)菌基因組進(jìn)行編輯，異源 Cas9 可能具有密碼子偏好性，在待編輯菌株中翻譯水平較低，因此有必要進(jìn)行密碼子優(yōu)化。內(nèi)源性CRISPR/Cas 系統(tǒng)需要對(duì)目標(biāo)菌株的 CRISPR/Cas 系統(tǒng)進(jìn)行充分表征，且機(jī)制較為復(fù)雜，但編輯效率可能更高，降低了多重基因編輯的門檻。

目前 CRISPR/Cas 基因編輯技術(shù)在乳酸菌基因組中的應(yīng)用集中在點(diǎn)突變、基因敲除、基因敲入等，實(shí)現(xiàn)大片段缺失、等位基因替換仍然具有挑戰(zhàn)性，內(nèi)源性的自體靶向CRISPR/Cas 系統(tǒng)可以指導(dǎo)細(xì)菌基因組在種群水平上的顯著進(jìn)化，影響基因組的穩(wěn)態(tài)和重塑。

換用強(qiáng)啟動(dòng)子增加sgRNA 的轉(zhuǎn)錄量能提高編輯效率，CRISPR/Cas9 與輔助修復(fù)途徑偶聯(lián)，避開 DSB，截短gRNA 遠(yuǎn) PAM 端序列和噬菌體介導(dǎo)將序列整合到受體質(zhì)粒上是乳酸菌基因組編輯的有效策略。

通過優(yōu)化cas9序列，成功降低了脫靶活性利用 DSB 對(duì)大部分無NHEJ 修復(fù)機(jī)制細(xì)菌都是致命的這一特點(diǎn)，可以制成基于 CRIPSR/Cas 系統(tǒng)的抗菌劑。

利用外源CRISPR/Cas 系統(tǒng)進(jìn)行單基因編輯已不是難題，但多基因編輯仍然面臨挑戰(zhàn)。很多 CRISPR/Cas 系統(tǒng)在模式菌株中表現(xiàn)良好，在非模式菌株中表現(xiàn)得卻不盡如人意。

參考文獻(xiàn)：李偉勛, 蘆晶, 張書文, 逄曉陽(yáng), 呂加平. CRISPR/Cas基因組編輯技術(shù)在乳酸菌中的應(yīng)用及研究展望[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2021, 61(10)