使用兩個大腸桿菌與希瓦氏菌穿梭質粒pETS與pSB1C3-repB，其在placI啟動子驅動下具表達能力。用單克隆法將編碼偶氮還原酶的azoRI基因重組到質粒載體中，質粒在外源基因插入位點的上游，均已引入了啟動子placI。使用自殺質粒pDS3.0用于敲除MR-1的基因mtrA。目標基因mtrA的上游Ｎ端片段和下游Ｃ端片段可通過融合ＰＣＲ結合，即mtrA-NC。再運用酶切連接方法將其插入pDS3.0上SacI與SmaI酶切位點之間形成敲除載體pDS3.0-mtrA。

參考文獻：[1]蘇暢.奧納達希瓦氏菌重組表達偶氮還原酶及mtrA基因敲除研究[D].廈門大學,2017.