該技術(shù)基于一套模塊化的單質(zhì)粒系統(tǒng)，主要由兩部分構(gòu)成：

1、先導(dǎo)編輯器（Prime Editor）：一個融合了Cas9切口酶（nCas9）和逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）的蛋白。

2、先導(dǎo)編輯向?qū)NA（pegRNA）：它不僅負(fù)責(zé)導(dǎo)航定位，還攜帶了需要插入的基因編輯模板。

工作流程：

1、定位與切口：先導(dǎo)編輯器在pegRNA的引導(dǎo)下找到目標(biāo)DNA序列，nCas9部分在非目標(biāo)DNA鏈上制造一個單鏈切口。

2、逆轉(zhuǎn)錄與編輯：pegRNA上的結(jié)合位點（PBS）與切開的DNA鏈結(jié)合，啟動逆轉(zhuǎn)錄過程。逆轉(zhuǎn)錄酶以pegRNA上的模板（RTT）為藍(lán)圖，合成一段包含預(yù)設(shè)編輯（如插入、刪除或堿基替換）的新DNA序列。

3、修復(fù)與整合：細(xì)胞自身的DNA修復(fù)機(jī)制會將這段新合成的、已編輯的DNA鏈整合到基因組中，從而完成精準(zhǔn)的基因修改。

圖 1 適配 EcN 的先導(dǎo)編輯系統(tǒng)。(A) 先導(dǎo)編輯作用原理示意圖。簡言之，先導(dǎo)編輯器依靠 nCas9 在 R 環(huán)內(nèi)無向?qū)?RNA 結(jié)合的 DNA 單鏈上制造單鏈切口，并通過特異性 pegRNA 向基因組引入預(yù)設(shè)的基因編輯突變。(B) 系列工作質(zhì)粒 pRC 的模塊化設(shè)計。模塊 1：nCas9 與逆轉(zhuǎn)錄酶 RT 由可誘導(dǎo)啟動子lacI-Ptrc調(diào)控，lacI蛋白可抑制該啟動子本底表達(dá)；模塊 2：pegRNA 由組成型強啟動子 P_J23119 驅(qū)動表達(dá)；載體還包含模塊 3 溫敏復(fù)制子、模塊 4 篩選標(biāo)記元件。

本體系完全省去傳統(tǒng) RNA 載體體外純化、人工組裝、全程冷鏈儲存等繁瑣流程，僅依靠活體工程菌在腫瘤病灶原位持續(xù)生產(chǎn)載核酸 OMV，為低成本、長效、通用型腫瘤 RNA 免疫治療提供全新微生物遞送平臺。

參考文獻(xiàn)

"Utilizing Engineered Probiotic Escherichia coli Nissle 1917 ΔnlpI as In Vivo Cell Factory for In Situ Self-Assembled RNA-Laden Outer Membrane Vesicles to Boost Tumor Immunotherapy"

文獻(xiàn)鏈接

Precision engineering of the probiotic Escherichia coli Nissle 1917 with prime editing