構建含有阿拉伯糖誘導啟動子下的λ-紅重組基因、鼠李糖誘導啟動子下的翻板酶重組酶（FLP）基因、溫度敏感復制起點和抗生素抗性選擇標記的敲除菌株。鑒于產酸桿菌BW21對氨芐青霉素具有天然抗性，我們在質粒pSIIJ8中用四環素抗性基因替換了氨芐青霉素抗性基因，得到質粒pSIJ-8-tet。用質粒pSIJ8-tet轉化K.oxytoca BW21。使用質粒pKD4作為模板，使用與靶基因上游和下游區域同源的50至100 bp延伸的引物構建敲入式盒PCR產物。通過電穿孔將擴增的FRT-Kanr-FRT盒引入攜帶pSIJ8-tet的菌株中，并通過基于λ紅的重組在靶染色體位點進行重組。

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參考文獻：Tao W, Wang Y, Walters E, Lin H, Li S, Huang H, Kasuga T, Fan Z. Homoethanol Production from Glycerol and Gluconate Using Recombinant Klebsiella oxytoca Strains. Appl Environ Microbiol. 2019 Feb 20;85(5):e02122-18.