| 菌株簡介 |
DUALmembrane系統(tǒng)是DUALsystems BioTech公司開發(fā)的專門篩選跨膜蛋白間相互作用的檢測技術(shù)，它利用分離的泛素系統(tǒng)（split-ubiquitin）直接檢測天然狀態(tài)下膜蛋白間的相互作用，是目前市面上唯一檢測膜蛋白間相互作用的酵母雙雜系統(tǒng)。此系統(tǒng)采用NMY51酵母菌株，可直接轉(zhuǎn)化質(zhì)粒進(jìn)行蛋白互作驗(yàn)證或篩庫試驗(yàn)；此菌株Transformation marker為: trp1, leu2-3，報告基因?yàn)椋篐IS3, ADE2 和 lacZ，第一步通過營養(yǎng)缺陷型報告基因（HIS3, ADE2）進(jìn)行選擇性生長篩選，進(jìn)一步通過 LacZ 報告基因進(jìn)行β-半乳糖分析顯色的定量或半定量篩選，三個獨(dú)立的報告基因，受不同啟動子的調(diào)控，降低假陽性幾率。原理：泛素（ubiquitin）分子量很小，由 76aa 殘基組成；泛素作為降解信號分子，可以連接另外一種蛋白質(zhì)的 N 端，然后被泛素專一性蛋白酶（UBPs）識別，從而導(dǎo)致與泛素相連的蛋白被酶解。泛素可以人為分成兩部分：N 端（Nub），C 端（Cub）。首先，人為地將泛素 Nub 的 3 位異亮氨酸突變?yōu)楦拾彼幔∟ubI 突變?yōu)?NubG）。這樣與 Cub 的親合力大大降低，避免了 Cub 和 Nub 自我結(jié)合或接近的可能性。其次，將Cub 部分與人工合成的 LexA-VP16 轉(zhuǎn)錄激活因子融合成一個融合蛋白Cub-LexA-VP16。正常條件下 NubG不與Cub 結(jié)合，UBPs 也不能識別分離的泛素，轉(zhuǎn)錄激活因子也不會被切下來。最后，將要檢測的蛋白質(zhì)分別與NubG和Cub融合，形成 bait 融合蛋（bait-cub-LexA -VP16）和 prey 融合蛋白（prey-NubG）。如果 bait 和 prey發(fā)生相互作用，就會促使 NubG 和 Cub 的相互接近，被 UBPs 識別，導(dǎo)致 LexA-VP16 的解離，進(jìn)入核內(nèi)，從而激活報告基因的轉(zhuǎn)錄。 此系統(tǒng)可使用四種Bait質(zhì)粒：pBT3-N，pBT3-SUC，pBT3-STE，pBT3-C，篩選標(biāo)志均為LEU；三種Prey質(zhì)粒：pPR3-C ，pPR3-SUC，pPR3-STE，篩選標(biāo)志均為TRP。NMY51酵母菌株可用YPDA在28℃有氧的條件下培養(yǎng)，然后使用30%的甘油保藏菌種。 |
