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人結腸黏膜上皮細胞

人結腸組織

上皮細胞樣

HIV-1、 HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌檢測陰性。

RPMI-1640培養基;優質胎牛血清，10%;雙抗，1%。

貼壁生長

凍存液一般為90%FBS+10%DMSO或70%基礎培養基+40%FBS+5%DMSO，現用現配

Moyer,MP,Manzano,LA,Merriman,RL等人在1995年10月3日公布(1996年6月發表)NCM460細胞的建立。源自一名西班牙裔68歲男性胃癌患者的正常結腸組織。表達結腸上皮細胞相關抗原，如細胞角蛋白和絨毛蛋白，但對與其他細胞類型相關的抗原(如神經或內皮細胞)呈陰性。一些細胞對粘蛋白合成呈陽性，通過使用特殊染色劑或抗體的標準染色方法確定，群體倍增時間約為32-38小時。初步表征表明它具有正常的生長特征并且不致瘤.初步表征表明NCM460細胞不在軟瓊脂中生長，并且不會產生腫瘤(Moyer等，1996)。 最近主要由INCELL合作者完成的研究表明，NCM460細胞系和選定的亞群在軟瓊脂中生長的能力不同，顯示出異常的核型并且可能是致瘤性的。這些測定中使用的確切條件和細胞密度在研究組之間不一致。然而，我們目前的解釋是，作為體外選擇的結果，細胞系表達了轉化的表型，但保留了正常結腸上皮細胞的許多功能 方面。個別研究人員應評估這些信息和實驗數據是否適合在他們的個人研究或應用中使用。

待細胞生長狀態良好時，可進行細胞凍存。下面T25瓶為例； 1．細胞凍存時，棄去培養基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，細胞變圓脫落后，加入2ml完全培養基終止消化，可使用血球計數板計數。 2．1000RPM離心5分鐘去掉上清。用血清重懸浮，加DMSO至最終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數量分配到凍存管中，注意凍存管做好標識。明舟生物按每個凍存管細胞數目大于1X106個細胞凍存。3．將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個小時以后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養瓶中培養過夜（或將細胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養基，培養過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。1. 棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。2. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養瓶中，置于37℃培養箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加少量培養基終止消化。3. 按6-8ml/瓶補加培養基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻。4. 將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養基的新皿中或者瓶中。