以質粒pLL25為模板,PCR擴增獲得上下游同源臂HA-1、HA-2;以pIB184-eGFP為模板,擴增獲得插入片段P23-eGFP。割膠回收上下游同源臂HA-1、HA-2及插入片段P23-eGFP,overlap獲得片段HA-1+P23+eGFP+HA-2,割膠回收。ApaI和XbaI雙酶切質粒pLL25骨架,割膠回收獲得線性化載體。將線性化載體骨架與目的片段HA-1+P23+eGFP+HA-2無縫克隆連接,構建獲得重組質粒pYSH。

參考文獻：[1]宋馨,王慧,袁世豪,等.基于CRISPR/Cas9系統對乳酸乳球菌進行綠色熒光蛋白標記[J].食品與發酵工業, 2022,48(2):163-167.