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人氣管組織，原代凍存

5×105cells/T25培養瓶

貼壁

成纖維細胞樣

DMEM高糖培養基，含FBS、平滑肌細胞生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

HIV-1、 HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌檢測陰性。

如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。1. 棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。2. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養瓶中，置于37℃培養箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加少量培養基終止消化。3. 按6-8ml/瓶補加培養基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻。4. 將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養基的新皿中或者瓶中。

將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養瓶中培養過夜（或將細胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養基，培養過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

氣道平滑肌是維持氣道張力的根本。它存在于氣管、支氣管樹直至終末支氣管。其特異的超微結構特點和調節機制是實現氣管正常生理功能的基礎。有證據表明氣管平滑肌在肺的發育過程以及諸如哮喘病、慢性支氣管炎和肺氣腫等疾病狀態下經歷著顯著的表型變化。另外，氣道平滑肌通過分泌細胞因子和趨化因子等促炎介質，發揮免疫調節功能。培養的氣管平滑肌細胞能表達三種P21活化的激酶（PAK）的同型異構體和PAK1，并通過P38 mapk信號途徑參與氣管平滑肌細胞的遷移。氣道平滑肌細胞增殖已成為人們關注的焦點，因為在哮喘病人中，此細胞是氣道壁重塑反應中數量上的重要組分，并被認為是新型抗哮喘病藥物的作用目標。

待細胞生長狀態良好時，可進行細胞凍存。下面T25瓶為例； 1．細胞凍存時，棄去培養基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，細胞變圓脫落后，加入2ml完全培養基終止消化，可使用血球計數板計數。 2．1000RPM離心5分鐘去掉上清。用血清重懸浮，加DMSO至最終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數量分配到凍存管中，注意凍存管做好標識。本公司按每個凍存管細胞數目大于1X106個細胞凍存。3．將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個小時以后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。