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昆明、C57小鼠（3-4周齡）8-10只

5×105cells/T25培養瓶

貼壁

成纖維細胞樣

DMEM高糖培養基，含FBS、平滑肌細胞生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

HIV-1、 HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌檢測陰性。

如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。1. 棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。2. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養瓶中，置于37℃培養箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加少量培養基終止消化。3. 按6-8ml/瓶補加培養基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻。4. 將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養基的新皿中或者瓶中。

將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養瓶中培養過夜（或將細胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養基，培養過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

哮喘是一種常見的氣道慢性炎癥性疾病，目前我國有約 2000 萬人罹患哮喘。近些年，由于霧霾等空氣質量與環境污染程度的日益惡劣，呼吸系統疾病也逐漸成為了全世界范圍影響人類健康最嚴重的慢性疾病之一，據世界衛生組織預測，到2025年，世界上將會有 4 億人患上哮喘。哮喘發 病 癥 狀 眾 多，早 期 表 現 為 過 敏 性 炎癥，后期由于氣管平滑肌增生，阻塞氣管，導致氣道狹窄、氣道高反應及氣道重塑，患者出現胸悶、氣喘等癥狀，嚴重時危及生命。因此，對哮喘的發病機理與治療的研究是至關重要的。在對哮喘發病機制的研究中，氣管平滑肌是針對氣道阻塞性癥狀的主要研究目標之一，針對氣 管 平 滑 肌 細 胞 ( airway smooth muscle cells，ASMCs) 的形態學觀察與細胞增殖速率的測量是在細胞生物學水平研究哮喘發病機制的常用手段。

待細胞生長狀態良好時，可進行細胞凍存。下面T25瓶為例； 1．細胞凍存時，棄去培養基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，細胞變圓脫落后，加入2ml完全培養基終止消化，可使用血球計數板計數。 2．1000RPM離心5分鐘去掉上清。用血清重懸浮，加DMSO至最終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數量分配到凍存管中，注意凍存管做好標識。本公司按每個凍存管細胞數目大于1X106個細胞凍存。3．將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個小時以后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。