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中國成年病人手術后的胃癌組織。

5×105cells/T25培養(yǎng)瓶

貼壁

HIV-1、 HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌檢測陰性。

如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。2. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。3. 按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。4. 將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或將細胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

胃癌組織源性微環(huán)境由功能性上皮、細胞外基質和間質細胞三部分組成。 腫瘤微環(huán)境主要包括： 1、微環(huán)境是細胞基因不穩(wěn)定性的來源,可以誘發(fā)基因突變和DNA 損傷,并導致DNA 修 復通路失調； 2、許多有明確致癌作用的理化因素(慢性炎癥、化學致癌物等)是通過破壞微環(huán)境的組 織結構、改變間質細胞因子表達譜并重塑細胞外基質,從而刺激功能細胞發(fā)生惡變的； 3、腫瘤細胞生長、侵襲、轉移所需的氧、營養(yǎng)成分和生長刺激信號被認為是來自于周 圍的間質細胞； 4、在適當的微環(huán)境中,惡性細胞可以被誘導恢復分化狀態(tài)； 5、細胞外基質中存在的抗腫瘤成分,例如：腫瘤抑素(tumstatin)、內皮抑素(endostatin)； 間質細胞主要包括成纖維細胞、各種免疫細胞和血管／淋巴管內皮細胞；此外,腫瘤細 胞還可以合成、分泌到細胞外間隙中新的基質成分。

待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。下面T25瓶為例； 1．細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，細胞變圓脫落后，加入2ml完全培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數板計數。 2．1000RPM離心5分鐘去掉上清。用血清重懸浮，加DMSO至最終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數量分配到凍存管中，注意凍存管做好標識。本公司按每個凍存管細胞數目大于1X106個細胞凍存。3．將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個小時以后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

1、成纖維細胞組織微環(huán)境中主要的間質細胞,也是產生間質細胞(例如Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型膠 原與纖維連接蛋白)和組織蛋白酶的主要細胞,處于“基質母細胞”的地位； 2、成纖維細胞是正常組織結構的“守護者”,存在抑制周圍上皮細胞發(fā)生惡變的機制, 已發(fā)生癌變的細胞在正常成纖維細胞環(huán)境下也可以向正常細胞分化； 3、成纖維細胞還是上皮細胞增生、分化的“調控者”,成纖維細胞發(fā)生轉化后可以表達 多種細胞因子、粘附分子直接作用于上皮細胞,促進腫瘤細胞的發(fā)生、生長、血管生成、浸 潤與轉移。