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SD大鼠（出生10-20天），2-3只

5×105cells/T25培養瓶

貼壁

成纖維細胞樣

DMEM高糖培養基，含FBS、Penicillin、Streptomycin等

HIV-1、 HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌檢測陰性。

如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。1. 棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。2. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養瓶中，置于37℃培養箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加少量培養基終止消化。3. 按6-8ml/瓶補加培養基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻。4. 將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養基的新皿中或者瓶中。

將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養瓶中培養過夜（或將細胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養基，培養過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

肝星狀細胞（HSC)位于Disse間隙內，緊貼著肝竇內皮細胞和肝細胞。其形態不規則，胞體呈圓形或不規則形，常伸出數個星狀胞突包繞著肝血竇。此外，HSC還伸出胞突與肝細胞、鄰近的星狀細胞相接觸。HSC是ECM的主要來源， HSC激活并轉化為肌成纖維細胞樣細胞(MFC)，各種致纖維化因素均把HSC作為最終靶細胞。肝星狀細胞激活并轉化為肌成纖維細胞樣細胞(MFC)，各種致纖維化因素均把HSC作為最終靶細胞，正常情況下肝星狀細胞處于靜止狀態。當肝臟受到炎癥或機械刺激等損傷時，肝星狀細胞被激活，其表型由靜止型轉變為激活型。激活的肝星狀細胞一方面通過增生和分泌細胞外基質參與肝纖維化的形成和肝內結構的重建，另一方面通過細胞收縮使肝竇內壓升高。

待細胞生長狀態良好時，可進行細胞凍存。下面T25瓶為例； 1．細胞凍存時，棄去培養基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，細胞變圓脫落后，加入2ml完全培養基終止消化，可使用血球計數板計數。 2．1000RPM離心5分鐘去掉上清。用血清重懸浮，加DMSO至最終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數量分配到凍存管中，注意凍存管做好標識。本公司按每個凍存管細胞數目大于1X106個細胞凍存。3．將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個小時以后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。